PCR: Das Fortschreiten der DNA-Analyse

In diesem Jahr jährt sich die Entdeckung der DNA im Jahr 1871 durch Johann Friedrich Miescher und Felix Hoppe-Seyler [1] zum 150 mal. Im Laufe der Jahrzehnte hat sich die DNA-Analyse und -Manipulation erheblich weiterentwickelt, was bedeutet, dass ihre Anwendungsmöglichkeiten größer geworden sind [2]. Ein Beispiel dafür ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), eine Technik, die heute weit verbreitet ist, um schnell Millionen bis Milliarden von Kopien einer bestimmten DNA-Sequenz herzustellen [2]. Im Jahr 1983 erfand Kary Banks Mullis die PCR, nachdem er mit einem US-amerikanischen Unternehmen zusammengearbeitet hatte, um die für das Verfahren benötigten Komponenten zu entwickeln [2]. Zu den für die PCR benötigten Komponenten gehören: Taq-Polymerase, eine DNA-Vorlage, Oligonukleotide, dNTPs, MgCl₂ und ein Thermocycler [2]. Die DNA-Vorlage ist wohl die wichtigste Komponente, da sie die Grundlage der Vervielfältigung ist [2]. Die benötigte Menge an genomischer DNA liegt bei 0,1 – 1 µg, jedoch ist die Menge irrelevant, wenn sie verunreinigt ist [2]. Die DNA-Vorlage muss rein sein, da selbst geringe Spuren von Substanzen wie EDTA die Taq-Polymerase hemmen können. Verunreinigungen können jedoch durch

Ethanolfällung und Waschen entfernt werden [2]. Die Taq-Polymerase synthetisiert DNA aus Nukleotiden und wurde 1986 in das PCR-Verfahren eingeführt, da sie thermotolerant ist und den für das PCR-Verfahren erforderlichen hohen Temperaturen standhalten kann [2]. Die verwendete Menge an Taq-Polymerase beträgt in der Regel 1 - 1,5 µl, aber wenn die Reinheit der DNA-Vorlage nicht gewährleistet ist, werden größere Mengen benötigt [2].

Es gibt viele verschiedene Arten der PCR, aber nur einige wenige werden häufig verwendet [3]. Die einfachste PCR-Methode ist vermutlich die gängigste[2]. Dabei wird die DNA-Vorlage erhitzt, so dass sie sich auftrennt und freie Nukleotide anlagern können. Diese Bindung wird anschließend von der Taq-Polymerase synthetisiert [2]. Wir verfügen über die notwendigen Ressourcen und Fähigkeiten, um in unserem hauseigenen Vertragslabor grundlegende PCR-Tests durchzuführen und damit Bakterien bis auf Artenebene zu identifizieren [4]. Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) ist eine Technik, bei der die reverse Transkription von RNA in DNA mit der anschließenden Amplifikation spezifischer Ziel-DNA mittels PCR kombiniert wird [3]. Die quantitative PCR (qPCR), auch Real Time PCR genannt, ermöglicht die Quantifizierung einer bestimmten DNA-Sequenz in Echtzeit durch Messung der DNA-Konzentration, während der Syntheseprozess stattfindet [5]. Dies wird am häufigsten mit Fluoreszenzfarbstoffen erreicht, die zwischen den DNA-Doppelsträngen anlagern [5].

PCR-Tests sind aufgrund von COVID-19 und ihrem Erfolg beim Nachweis des Virus ein aktueller Schwerpunkt in den Nachrichten [3]. Die RT-PCR, die RNA-Sequenzen des SARS-CoV-2-Virus nachweist, hat sich zum "Goldstandard" für die Diagnose von COVID-19 entwickelt [3]. Die Ergebnisse liegen innerhalb weniger Stunden vor und stellen derzeit die schnellste verfügbare Methode zur Überwachung des Vorhandenseins und der Ausbreitung der Infektion dar [3]. Obwohl andere Tests, wie z.B. CT-Scans von Patienten, COVID-19-Fälle schnell und genau erkennen können, werden sie unpraktikabel, sobald die Zahl der infizierten Personen groß wird.

Referenzen:

1. Dahm R. Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Developmental Biology. 2005;278(2):274-288.
2. Singh J, Birbian N, Sinha S, Goswami A. A critical review on PCR, its types and applications. International Journal of Advanced Research in Biological Sciences. 2014;1(7). 
3. Long C, Xu H, Shen Q, Zhang X, Fan B, Wang C et al. Diagnosis of the Coronavirus disease (COVID-19): rRT-PCR or CT?. European Journal of Radiology. 2020;126:108961.
4. de Jong A, Youala M, Klein U, El Garch F, Simjee S, Moyaert H et al. Minimal inhibitory concentration of seven antimicrobials to Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae isolates from six European countries. Avian Pathology. 2021;50(2):161-173.
5. Kralik P, Ricchi M. A Basic Guide to Real Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything. Frontiers in Microbiology. 2017;8.